富馬酸的制備方法

目前,工業(yè)上主要通過化學(xué)合成法和生物合成法制備富馬酸,下面將對這2種合成法進行詳細介紹并做比較?；瘜W(xué)合成法 富馬酸的化學(xué)合成法主要包括順丁烯二酸酐(順酐)異構(gòu)法和糠醛氧化法2種。順酐廣泛用于合 成樹脂、涂料、農(nóng)藥、潤滑油添加劑、醫(yī)藥、紙張?zhí)幚韯?、食品添加劑、穩(wěn)定劑等方面,是一種用量比較大的有機原料[1]?？啡┦且环N以農(nóng)林副產(chǎn)品水解獲得的重要有機化工原料,它在醫(yī)藥、獸藥、農(nóng)藥、染料、香料、涂料、塑料、電絕緣材料、助劑、試劑、溶劑、粘合劑、飼料添加劑、食品、合成樹脂、合成橡膠及合成纖維單體等工業(yè)部門有著十分廣泛的用途[7]。這2種制備方法的制備工藝和優(yōu)缺點如下

化學(xué)合成法制備富馬酸所面 臨的主要難題是化石資源的短缺、生產(chǎn)成本的提高以及對環(huán)境的污染。石油作為一種不可再生資源,其儲存量是有限的。石油的短缺使得世界石油市場供需嚴重失衡,導(dǎo)致目前石油價格飛漲,直接導(dǎo)致了苯、甲苯、乙烯、乙二醇等大宗化學(xué)品的價格大幅上漲,使下游制造業(yè)的成本負擔(dān)大幅度增加。因此,尋找新資源和能源,建立新的大宗化學(xué)品合成平臺已經(jīng)刻不容緩,關(guān)系到整個人類文明的可持續(xù)發(fā)展問題。

生物合成法 富馬酸的生物合成法具體包括酶催化轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。20世紀90年代中期出現(xiàn)的酶催化轉(zhuǎn)化法一般都是以馬來酸為底物,在馬來酸異構(gòu)酶作用下制備富馬酸。該方法具有較高的轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)率,如果和天冬氨酸酶聯(lián)合使用,還可以直接從馬來酸制備天冬氨酸,日本在這方面做了大量工作,并且研究發(fā)現(xiàn),某些馬來酸異構(gòu)酶能夠耐受50℃的高溫,可以極大地提高酶催化轉(zhuǎn)化效率。 20世紀初期就開始了霉菌發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的研究工作,隨著科學(xué)技術(shù)的進步,富馬酸得率一度到了30%～40%。不過,早期由于受技術(shù)水平的局限,對 微生物的生長代謝了解不夠深入,一直未能進行工業(yè)化生產(chǎn)。20世紀70年代石油危機的出現(xiàn),使得人們加大了對微生物發(fā)酵法制備富馬酸的研究力度,這一時期人們用來發(fā)酵制備富馬酸的微生物有霉菌、酵母及細菌。其中根霉菌(Rhizopus)由于具有營養(yǎng)要求簡單、環(huán)境適應(yīng)能力強以及生長迅速等特點,又是重點研究的對象,具體包括米根霉(Rhizopus oryzae)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)以及黑根霉(Rhizopusnigricans)等。

在這一時期,我國科學(xué)家對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸的研究工作也進行了一定的探索,其中山西微生物研究所的白照熙等篩選出了具有產(chǎn)富馬酸能力的少根根霉,當(dāng)振蕩培養(yǎng)于含有12%葡萄糖的培養(yǎng)基時,富馬酸產(chǎn)量為5315g/L,得率為45%,同時產(chǎn)生了較多的副產(chǎn)物如蘋果酸等。隨后,Federici等對根霉菌的發(fā)酵做了研究。發(fā)現(xiàn)根霉菌的固定化可以顯著提高菌體的穩(wěn)定性及生產(chǎn)效率;而適宜的攪拌速率和補加適量的中和劑都有助于產(chǎn)酸。1996年,美國Purdue大學(xué)的Tsao教授等利用米根霉具有自我固定的能力,設(shè)計了一種旋轉(zhuǎn)生物膜接觸器耦聯(lián)吸附柱的裝置,用于米根霉的發(fā)酵和富馬酸的吸附收集,這個發(fā)酵系統(tǒng)通過不斷地補料循環(huán),可以在20h內(nèi)利用質(zhì)量 ? 28?現(xiàn)代化工第25卷增刊 濃度為100g/L的葡萄糖生產(chǎn)出平均產(chǎn)量多達85g/L的富馬酸。 

2 代謝工程在生物合成富馬酸中的應(yīng)用 1991年,著名的生化工程專家———美國加州理 工學(xué)院(CaliforniaInstituteofTechnology)Bailey教授首次詳細論述了代謝工程,標(biāo)志代謝工程新學(xué)科的誕生。在這短短的十幾年里,代謝工程得到了突飛猛進的發(fā)展,它與細胞生物、基因工程等技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用已成為研究和控制微生物生長代謝的一個必不可少的手段。Wright等通過14C同位素標(biāo)記的方法得到了米根霉中的葡萄糖代謝模型,并分析證明了米根霉既可以發(fā)酵生產(chǎn)乳酸,又可 以發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸。

Longacre等采用代謝工程的方法對米根霉中葡萄糖的代謝流進行分析,最終把乳酸的產(chǎn)率從65%提升到75%～86%。國內(nèi)天津大學(xué)的白冬梅等對米根霉進行誘變育種,獲得了乳酸高產(chǎn)菌,詳細分析了誘變過程中代謝通量的變化,得出了米根霉發(fā)酵產(chǎn)乳酸的理論得率為9812%。同樣地,筆者認為通過代謝工程的手段必 定可以提高米根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的得率,降低其生產(chǎn)成本,從而提高其市場競爭力,為實現(xiàn)石油基大宗化學(xué)品的大范圍生物基替代做出重要貢獻。 

1—丙酮酸羧化酶;2—蘋果酸脫氫酶(胞液);3—富馬酸酶(胞 液);4—乳酸脫氫酶;5—丙酮酸脫羧酶;6—乙醇脫氫酶;7—丙酮酸脫氫酶復(fù)合體;8—檸檬酸合成酶;9—琥珀酸脫氫酶;     10—富馬酸酶;11—蘋果酸脫氫酶 NHD—煙酰胺腺嘌呤二核苷酸;NHDH2—還原NHD;ATP—三磷酸腺苷;TCA—三羧酸循環(huán);EMP—糖酵解途徑 圖1 Roryzae中葡萄糖代謝模型 在米根霉的葡萄糖代謝模型中(見圖1),存在2條富馬酸合成途徑。一個途徑是通過線粒體中的 三羧酸循環(huán),琥珀酸在琥珀酸脫氫酶的作用下生成 富馬酸,富馬酸可以借助于轉(zhuǎn)運系統(tǒng)通過線粒體膜進入胞液,也可在富馬酸酶催化下繼續(xù)反應(yīng)生成蘋果酸。另一個途徑存在于細胞液中,丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下與CO2反應(yīng)生成草酰乙酸,草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶的作用下生成蘋果酸,蘋果酸

經(jīng)過富馬酸酶的催化生成富馬酸,整個過程。細胞液生成富馬酸的代謝途徑分別對上述途徑進行分析比較,可以看出,胞液途徑的理論得率遠大于線粒體途徑,因此,有理由認為胞液途徑是富馬酸的主要合成途徑。為了提高富馬酸的實際得率,需要盡可能地增大胞液途徑的代謝流分布,但需要注意的是,不能過分減少線粒體途徑,因為它提供的能量占細胞生長和合成物質(zhì)所需能量的絕大部分。應(yīng)該在能保證提供足夠能量的基礎(chǔ)上,對整個代謝網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)控,通過增加胞液途徑的代謝通量來達到提高轉(zhuǎn)化率的目的。

米根霉中2條富馬酸代謝途徑的比較線粒體途徑 胞液途徑 理論反應(yīng)方程式 C6H12O6+3O2 C4H4O4+2CO2+4H2O C6H12O6+2CO22C4H4O4+2H2O 能量平衡(假設(shè)葡萄糖完全進入線粒體或胞液途徑)  共有的糖酵解過程,共產(chǎn)生2molATP和2molNADH 1mol丙酮酸經(jīng)過三羧酸循環(huán)共產(chǎn)生1molATP、1molNADH2和3molNADH。折算為1mol葡萄糖,ATP產(chǎn)能24mol。  

1mol丙酮酸生成富馬酸,需要1molNADH 和1molATP,折算為1mol葡萄糖,耗能與糖酵解的產(chǎn)能剛好抵 消。 理論摩爾得率 12理論質(zhì)量得率 6414% 12910% 3 結(jié)語 富馬酸作為一種重要的四碳平臺化合物,不論是研究其制備方法,特別是將生物高新技術(shù)比如代謝工程技術(shù)與現(xiàn)代化工技術(shù)、成熟工業(yè)技術(shù)相結(jié)合來生產(chǎn)富馬酸,還是研究其下游產(chǎn)品。